PMA光解儀在活菌檢測(cè)中的應(yīng)用

PMA光解儀在活菌檢測(cè)中的應(yīng)用 

PMA是一種高親和性的DNA結(jié)合染料，尤其與雙鏈DNA，該染料本身具有微弱的熒光，但與核酸結(jié)合后可以發(fā)出更為明亮的熒光。PMA具有細(xì)胞膜不可滲透性，因此可選擇性地修飾膜受損的死細(xì)胞的DNA。PMA修飾的DNA經(jīng)LUYOR-3419PMA光解儀藍(lán)光（~464 nm）光解后，PMA上的光反應(yīng)性疊氮基轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性氮烯自由基，與DNA結(jié)合位點(diǎn)附近的任何烴部分反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)氮碳鍵，從而導(dǎo)致性DNA 修飾。該修飾過(guò)程會(huì)使DNA不溶，且在后期的基因組DNA提取過(guò)程中與細(xì)胞碎片一起丟失。殘留在溶液中未結(jié)合的PMA，在強(qiáng)光照射下與水分子反應(yīng)分解成無(wú)交聯(lián)活性的羥胺化合物，使其不能再共價(jià)結(jié)合DNA?；赑MA的這一特性，我司將PMA與qPCR技術(shù)相結(jié)合，形成一種新的檢測(cè)方法—PMA-qPCR，用于活細(xì)菌的篩選。目前該法已在多種細(xì)菌菌株以及酵母、真菌、病毒和寄生蟲(chóng)中得到驗(yàn)證。

復(fù)雜樣品的處理，如糞便或土壤，可能會(huì)需要優(yōu)化樣品稀釋度、染料濃度和光處理時(shí)間。稀釋樣品的處理，如水測(cè)試，可能需要在染料處理前進(jìn)行過(guò)濾或濃縮。

疊氮溴化丙錠的介紹 

疊氮溴化丙錠(?PMA)是一種光敏反應(yīng)染料，它對(duì)DNA具有非常高的親和力。當(dāng)細(xì)胞膜處于不完整狀態(tài)或者細(xì)胞已經(jīng)死亡，細(xì)胞膜對(duì)外界的物質(zhì)的進(jìn)出就沒(méi)有了選擇性，PMA就可以順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與DNA進(jìn)行結(jié)合，在LUYOR-3419PMA光解儀光照作用下發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)后的DNA就不能作為模板進(jìn)行擴(kuò)增，殘留在溶液中的未被結(jié)合的PMA在光照下與水分子形成羥胺化合物，從而阻止其與在提取過(guò)程中活菌產(chǎn)生的DNA結(jié)合，影響檢測(cè)結(jié)果。而對(duì)于活的細(xì)胞而言，細(xì)胞膜具有選擇性，PMA便不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)。將PMA這種特性與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行偶聯(lián)，便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)活菌的檢測(cè)。 

影響活菌檢測(cè)的因素 

采集的樣品 

PMA偶聯(lián)熒光PCR技術(shù)對(duì)樣品的要求比較高。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中的樣品，食品樣品和臨床上的病料中常常含有一些無(wú)機(jī)物質(zhì)．有機(jī)物質(zhì)。這些物質(zhì)的存在既可以降低PMA的有效濃度，也可以干擾PMA與核酸的交聯(lián)反應(yīng)。詳細(xì)的說(shuō)，樣品中的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物會(huì)造成樣品的濁度提高，樣品越渾濁，光的透過(guò)性就越差，越影響PMA與樣品在光照條件下的交聯(lián)反應(yīng)。為了避免和減少因樣品采集帶來(lái)的誤差，Luo等人在一項(xiàng)研究中提出，要嚴(yán)格規(guī)范濁度的閾值，這樣對(duì)每一份樣品檢測(cè)具有更重要的意義和參考價(jià)值。有研究表明，當(dāng)樣品的濁度達(dá)到10個(gè)散射濁度單位的時(shí)候，樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA是沒(méi)有影響的。當(dāng)樣品的濁度高于10個(gè)散射濁度時(shí)，樣品的濁度對(duì)于PMA交聯(lián)DNA具有非常大的影響。 

PMA與DNA作用階段 

PMA與DNA作用階段主要是指PMA進(jìn)入細(xì)胞膜受損傷的過(guò)程和PMA結(jié)合DNA的過(guò)程。PMA是一種對(duì)光較為敏感的染料，即便在普通光源下，也能降低PMA的有效濃度。因此，在PMA與細(xì)胞核DNA作用的過(guò)程中要避光。在這個(gè)過(guò)程中，PMA的濃度、PMA與核酸的作用時(shí)間，溫度等都會(huì)影響終的檢測(cè)結(jié)果。有些學(xué)者在參考別的研究者活菌檢測(cè)技術(shù)時(shí)，設(shè)置了同樣的溫度、濃度和時(shí)間，但是結(jié)果卻不甚理想。其主要原因是樣品不同，佳的PMA的濃度和作用時(shí)間也會(huì)有很大的差異。如較低濃度時(shí)，PMA是不能夠完全結(jié)合掉的死菌DNA，那么部分沒(méi)有結(jié)合的死菌的DNA便可以作為模板被擴(kuò)增出來(lái)，從而造成活菌檢測(cè)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。如果PMA的濃度過(guò)高，PMA也可以滲入到活的細(xì)胞中，將部分活的細(xì)胞DNA結(jié)合掉，造成檢測(cè)結(jié)果的不準(zhǔn)確。因此，無(wú)論是做哪一項(xiàng)活菌檢測(cè)，PMA的濃度和作用時(shí)間等參數(shù)要先優(yōu)化，后使用。PMA進(jìn)入細(xì)胞的效率和有效結(jié)合DNA的效率還與溫度有關(guān)。有研究表明。在室溫的條件下，PMA結(jié)合DNA的效率高。另外，PMA與細(xì)胞的作用時(shí)間也要考慮到位。作用時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，PMA也能夠滲透到活細(xì)胞中，造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。