紫外激發(fā)光源激發(fā)植物GFP發(fā)光

紫外激發(fā)光源研究植物GFP發(fā)光

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）在收到紫光外或者藍(lán)光激發(fā)時(shí)，發(fā)射綠色熒光，可在各種異源細(xì)胞，如細(xì)菌/昆蟲(chóng)以及植物細(xì)胞中表達(dá)，在植物研究中，通常需要各種顯微鏡來(lái)確定該基因是否表達(dá)，偶爾也會(huì)因?yàn)橹参镒园l(fā)熒光導(dǎo)致假陽(yáng)性的誤判。

觀察GFP發(fā)光可用上海峰志實(shí)驗(yàn)室藍(lán)光手電筒LUYOR-3280RB，紫外線激發(fā)光源LUYOR-3280UV，顯微鏡熒光激發(fā)光源LUYOR-3420照射植物，同時(shí)需要佩戴專(zhuān)用的熒光觀察眼鏡,使用遮光片觀察效果更佳。GFP熒光反應(yīng)用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到，且靈敏度高，對(duì)于單細(xì)胞水平的表達(dá)也可識(shí)別。

綠色熒光蛋白在紫外線的激發(fā)下發(fā)光

GFP是從水母分離出的一種天然熒光蛋白，分子量約27000。為一個(gè)由238個(gè)氨基酸殘基組成的單鏈多肽，其熒光發(fā)射峰在509nm，zui大激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，并在470 nm處有一肩峰，GFP的化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，其變性需在90℃或pH<4．0或pH>12．0的條件下用6mol／L鹽酸胍處理。GFP的熒光發(fā)光有兩個(gè)明顯的吸收帶，對(duì)應(yīng)于GFP的兩種不同構(gòu)象的基態(tài)A和B?；鶓B(tài)A對(duì)應(yīng)于395nm的吸收峰，基態(tài)B對(duì)應(yīng)于475nm的吸收峰，基態(tài)A占優(yōu)勢(shì)，基態(tài)B的分子數(shù)量約是基態(tài)A的1／6，兩種基態(tài)間能緩慢地轉(zhuǎn)換，但激發(fā)態(tài)A 之間的轉(zhuǎn)換很快且發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移，A 快速高效地衰變至另一激發(fā)態(tài)，應(yīng)該存在一個(gè)中間過(guò)度態(tài)I，質(zhì)子轉(zhuǎn)移使A 轉(zhuǎn)變成I ，I 回遷到基態(tài)I時(shí)產(chǎn)生發(fā)射峰504nm的熒光，構(gòu)象改變使I 轉(zhuǎn)變成B ，由B到B發(fā)射熒光而不發(fā)生質(zhì)子轉(zhuǎn)移。目前，對(duì)于GFP的作用機(jī)理較為認(rèn)同的僅僅是：GFP是生物發(fā)光過(guò)程中的能量受體，并且是zui終的發(fā)光體，不同的生物發(fā)光機(jī)制各不相同，不同的突變體發(fā)光機(jī)制也有很大差異。

圖一：紅色熒光蛋白在LUYOR-3415RG激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)光

除此之外，上海峰志實(shí)驗(yàn)室燈還可以用做以下用途：

1、 野外、實(shí)驗(yàn)室原位測(cè)定GFP(綠色熒光蛋白)。

2、 應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物研究。

3、 區(qū)別可遺傳性改良生物體和不可遺傳的改良生物體。

4、 用于基因表達(dá)的研究。

5、 用于Rhodamine（紅色熒光染料）、葉綠素、熒光素的研究。

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

綠光蛋白GFP吸收的光譜峰值為395nm（紫外），并有一個(gè)峰值為470nm的副吸收峰（藍(lán)光）；雖然450～490nm只是GFP的副吸收峰，但由于長(zhǎng)波能量低，細(xì)胞忍受能力強(qiáng)，更適合活體檢測(cè)，因此通常多使用藍(lán)光波段光源（多為488nm）。GFP發(fā)射光譜zui大峰值為509nm（綠光），并帶有峰值為540nm的側(cè)峰（Shouder）。

圖二：LUYOR-3280UV紫外激發(fā)光源

為什么藍(lán)光和紫外線激發(fā)光源能激發(fā)GFP發(fā)出綠色熒光？

熒光蛋白GFP發(fā)光原理

熒光蛋白發(fā)光類(lèi)型屬于斯托克斯位移型，其基本原理是生色團(tuán)在較高能量的光子照射下發(fā)生構(gòu)象的改變，從而導(dǎo)致分子能級(jí)變化，從高能級(jí)的構(gòu)象躍遷向低能級(jí)時(shí)發(fā)出較低能量的光子。生色團(tuán)在發(fā)光過(guò)程中主要有兩種化學(xué)過(guò)程。一是質(zhì)子轉(zhuǎn)移，即質(zhì)子化和去質(zhì)子化，二是分子構(gòu)象的改變。生色團(tuán)主要有三種構(gòu)象：A型、B型以 及中間過(guò)渡態(tài)Z 型。在分子構(gòu)象變化的同 時(shí)還伴隨著氫鍵的生成和斷裂，以及電荷的傳遞去質(zhì)子化和質(zhì)子化的分子構(gòu)象不同， 對(duì)應(yīng)的分子能級(jí)也不同，從而其發(fā)射光譜中有兩個(gè)特征峰，代表兩種躍遷過(guò)程。質(zhì)子化構(gòu)象生色基團(tuán)通過(guò)Tyr66 的脫質(zhì)子狀和質(zhì)子化狀態(tài)(酚羥基)的轉(zhuǎn)換決定熒光發(fā)射。由于酚的激發(fā)態(tài)酸性遠(yuǎn)大于其基態(tài), 故僅脫質(zhì)子態(tài)的結(jié)構(gòu)發(fā)射熒光。這個(gè)過(guò)程是十分迅速的，因此熒光蛋白發(fā)射的是熒光而不是磷光，需要激發(fā)光源持續(xù)存在才可連續(xù)發(fā)光。但是其極快的激發(fā)響應(yīng)使得熒光蛋白適合作為高靈敏度生物探針以及生物成像材料。

圖三：LUYOR-3415RG激發(fā)光源照射煙草葉片的GFP發(fā)光

熒光蛋白GFP發(fā)光特性

GFP熒光極其穩(wěn)定，在激發(fā)光照射下，GFP抗光漂白（Photobleaching）能力比熒光素強(qiáng)，特別是在450～490nm藍(lán)光波長(zhǎng)下更穩(wěn)定。在熒光顯微鏡下，GFP融合蛋白的熒光靈敏度遠(yuǎn)比熒光素標(biāo)記的熒光抗體高，抗光漂白能力強(qiáng)，因此更適用于定量測(cè)定與分析。由于GFP熒光的產(chǎn)生不需要任何外源反應(yīng)底物，因此GFP作為一種廣泛應(yīng)用的活體報(bào)告蛋白，其作用是任何其它酶類(lèi)報(bào)告蛋白無(wú)法比擬的。但因?yàn)镚FP不是酶，熒光信號(hào)沒(méi)有酶學(xué)放大效果，因此GFP靈敏度可能低于某些酶類(lèi)報(bào)告蛋白，比如熒光蛋白的應(yīng)用非常的廣泛，已經(jīng)應(yīng)用于分子標(biāo)記，體內(nèi)示蹤，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，藥物篩選等生物科研的各個(gè)方面熒光讓我們能夠檢測(cè)分子的構(gòu)象變化，也能讓我們追蹤化學(xué)反應(yīng)…. 是科學(xué)研究的重要手段之一。

熒光蛋白激發(fā)的日常用途

熒光蛋白+激發(fā)光源在生物基因研究中發(fā)揮著巨大的作用，熒光蛋白在激發(fā)光源的激發(fā)下發(fā)出熒光，使得研究效果更直觀。以下為熒光蛋白的10個(gè)日常用途，本文為上海峰志摘錄，僅供參考。關(guān)于激發(fā)光源選擇，請(qǐng)咨詢(xún)上海峰志：網(wǎng)頁(yè)底部.

（1） Localization：可以放在目的基因的N端，也可以放在目的基因的C端。這樣的構(gòu)建方式可以幫助我們觀察到目的基因是什么時(shí)候開(kāi)始表達(dá)以及在哪里表達(dá)；

（2） Transcription reporter：將熒光蛋白放在待研究啟動(dòng)子的后面，可以很好的觀察或者驗(yàn)證該啟動(dòng)子在特定細(xì)胞中的啟動(dòng)活性；

（3） FRET(Frster Resonance Energy Transfer):用來(lái)研究?jī)蓚€(gè)不同的蛋白或者用一個(gè)蛋白的兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域之間的相互作用關(guān)系。通常是使用激發(fā)/發(fā)射光譜有重疊的兩個(gè)熒光蛋白。目前蛋白-蛋白相互作用研究中zui廣泛應(yīng)用的FRET對(duì)就是青色熒光蛋白（cyan fluorescent protein, CFP）、黃色熒光蛋白（yellow fluorescent protein, YFP）。

（4） Split EGFP：FRET的另一種實(shí)現(xiàn)方法，同樣被用來(lái)研究蛋白與蛋白的相互作用。具體是將EGFP分割成兩部分，分別融合到兩個(gè)蛋白，當(dāng)兩個(gè)蛋白靠近時(shí)，EGFP的兩部分蛋白開(kāi)始折疊，成熟到發(fā)光。

（5） Biosensors：用來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)小生物分子或其他生理過(guò)程，比如AAV載體中的鈣指示劑。

（6） Optogenetics：是研究人員使用一種新的光控方法選擇并打開(kāi)了某種生物的一類(lèi)細(xì)胞。光遺傳技術(shù)–21世紀(jì)神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域zui引人注目的革新，其主要原理是首先采用基因操作技術(shù)將光感基因（如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等）轉(zhuǎn)入到神經(jīng)系統(tǒng)中特定類(lèi)型的細(xì)胞中進(jìn)行特殊離子通道或GPCR的表達(dá)。光感離子通道在不同波長(zhǎng)的光照刺激下會(huì)分別對(duì)陽(yáng)離子或者陰離子的通過(guò)產(chǎn)生選擇性，從而造成細(xì)胞膜兩邊的膜電位發(fā)生變化，達(dá)到對(duì)細(xì)胞選擇性地興奮或者抑制的目的。

（7） Chemogenetics：利用遺傳學(xué)原理，以化學(xué)小分子為工具解決生物的問(wèn)題，或通過(guò)干擾、調(diào)節(jié)正常生理過(guò)程了解蛋白質(zhì)的功能。

（8） In Vivo Imaging：活體成像系統(tǒng)成像原理包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)底物發(fā)生生化反應(yīng)產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號(hào);而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因(GFP、RFP)或熒光染料(包括熒光量子點(diǎn))等新型納米標(biāo)記材料進(jìn)行標(biāo)記，利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的生物光源。前者是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光，不需要激發(fā)光源，而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。

（9） Cell marking/selection：大家做細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通常都喜歡質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)簽比如GFP，有了該熒光標(biāo)簽可以很方便的判斷質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。這種情況通常是熒光蛋白由另外一個(gè)不同的啟動(dòng)子控制或者由與目的基因相同的啟動(dòng)子控制但是通過(guò)IRES連接。

（10） FACS：流式細(xì)胞分選技術(shù)，可以方便的分選出帶有熒光蛋白的細(xì)胞，分選出的細(xì)胞可以進(jìn)行培養(yǎng)或其它處理，做更深的研究.

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