PCR的基本原理和操作步驟

PCR的基本原理和操作步驟

普通PCR概述
 聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學技術，用于放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）zui早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E.  Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則于80年代之后。

PCRzui初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當年服務于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.  Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了篇相關的論文。此后，PCR的運用一日千里，相關的論文發(fā)表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨后PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的zui重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。 

2 PCR原理
PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；
②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

3 PCR反應體系與反應條件 

3.1標準的PCR反應體系

3.2 PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。［PCR步驟］

　　標準的PCR過程分為三步：
 1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。
 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性zui佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。
 每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。 

4 PCR反應特點 

4.1特異性強   PCR反應的特異性決定因素為：
 ①引物與模板DNA特異正確的結合；
 ②堿基配對原則；
 ③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
 ④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 

 4.2 靈敏度高
 PCR產物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中zui小檢出率為3個細菌。 
  

4.3簡便、快速
 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
 

4.4 對標本的純度要求低
 不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。 

PCR常見問題 

5.1假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶
 PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有：
①模板核酸的制備，
②引物的質量與特異性，
③酶的質量及，  
④PCR循環(huán)條件。

尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
 模板：
①模板中含有雜蛋白質，
②模板中含有Taq酶抑制劑，
③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，
④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。
⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處  理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。
 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
 引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度  高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。
④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
 反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul  后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
 物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。
 

5.2 假陽性
 出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
 引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。
 靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，試劑或器材均應高壓。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
 

5.3 出現(xiàn)非特異性擴增帶
 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、  或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)  過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次  數(shù)。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
 

5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃  度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。