PCR的基本原理和操作步驟

PCR的基本原理和操作步驟

普通PCR概述
 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)，簡稱PCR，是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段?？煽醋魃矬w外的特殊DNA復(fù)制。DNA聚合酶（DNA polymerase I）zui早于1955年發(fā)現(xiàn)，而較具有實(shí)驗(yàn)價值及實(shí)用性的Klenow fragment of E.  Coli 則是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發(fā)現(xiàn)，但由于此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?，F(xiàn)今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是于1976年從溫泉中的細(xì)菌（Thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在于能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運(yùn)用則于80年代之后。

PCRzui初的原始雛形概念是類似基因修復(fù)復(fù)制，它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發(fā)表了個單純且短暫性基因復(fù)制（類似PCR前兩個周期反應(yīng)）的實(shí)驗(yàn)。而現(xiàn)今所發(fā)展出來的PCR則于1983由 Dr. Kary B. Mullis發(fā)展出的，Dr. Mullis當(dāng)年服務(wù)于PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr.  Mullis 并于1985年與Saiki 等人正式發(fā)表了篇相關(guān)的論文。此后，PCR的運(yùn)用一日千里，相關(guān)的論文發(fā)表質(zhì)量可以說是令眾多其它研究方法難望其項(xiàng)背。隨后PCR技術(shù)在生物科研和臨床應(yīng)用中得以廣泛應(yīng)用，成為分子生物學(xué)研究的zui重要技術(shù)。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎。 

2 PCR原理
PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；
③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

3 PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件 

3.1標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

3.2 PCR反應(yīng)五要素

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。［PCR步驟］

　　標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：
 1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA
 2.退火（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。
 3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性zui佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。
 每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。 

4 PCR反應(yīng)特點(diǎn) 

4.1特異性強(qiáng)   PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：
 ①引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；
 ②堿基配對原則；
 ③Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；
 ④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合(復(fù)性)可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。 

 4.2 靈敏度高
 PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位)；在細(xì)菌學(xué)中zui小檢出率為3個細(xì)菌。 
  

4.3簡便、快速
 PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在2～4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
 

4.4 對標(biāo)本的純度要求低
 不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。 

PCR常見問題 

5.1假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶
 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有：
①模板核酸的制備，
②引物的質(zhì)量與特異性，
③酶的質(zhì)量及，  
④PCR循環(huán)條件。

尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
 模板：
①模板中含有雜蛋白質(zhì)，
②模板中含有Taq酶抑制劑，
③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，
④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。
⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處  理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。
 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。
 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度  高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：
①選定一個好的引物合成單 位。
②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
 反應(yīng)體積的改變：通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul  后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
 物理原因：變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
 靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會成功的。
 

5.2 假陽性
 出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
 引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。
 靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，試劑或器材均應(yīng)高壓。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇樱c引物互補(bǔ)后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
 

5.3 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶
 PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶 與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、  或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)  過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次  數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
 

5.4出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶
 PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃  度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。