毛細管電泳的原理和優(yōu)勢

什么是毛細管電泳？

毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫效毛細管電泳(HPCE), 是近年來發(fā)展快的分析方法之。效毛細管電泳是類以毛細管為分離通道、以壓直流電場為驅動力的新型液相分析技術。毛細管電泳是將電泳的場所置于毛細管中的種電泳分離方法，它的裝置結構通常由壓電源、鉑電、緩沖液池、樣品池、毛細管、檢測器和分析記錄儀構成。

毛細管電泳的原理和過程是怎樣的？

毛細管電泳分離的基本流程有進樣、分離和檢測三步驟。進樣：毛細管電泳的基本裝置是根充滿電泳緩沖液的毛細管，與毛細管兩端相連的兩個小瓶微量樣品從毛細管的端通過“壓力”或“電遷移”進入毛細管；分離：電泳時，與壓電源連接的兩個電分別浸人毛細管兩端小瓶的緩沖液中。樣品朝與自身所帶電荷性相反的電方向泳動。各組分因其分子大小、所帶電荷數(shù)、等電點等性質的不同而遷移速率不同，依次移動至毛細管輸出端附近的光檢測器，檢測、記錄吸光度，并在屏幕上以遷移時間為橫坐標，吸光度為縱坐標將各組分以吸收峰的形式動態(tài)直觀地記錄下來；檢測：檢測的原理基于被測組分和背景電解質的吸光度不同，當被測組分通過檢測窗時，吸光度發(fā)生的變化服從朗伯-比爾定律，即在定的實驗條件下，吸光度與被測組分的濃度成正比。

毛細管電泳和普通電泳相比較的勢在哪里？

通常電流通過導體時都會產(chǎn)生焦耳熱。傳統(tǒng)平板凝膠電泳的大局限性在于，其無法克服兩端電壓帶來的焦耳熱所產(chǎn)生的負面影響。焦耳熱可使篩分介質內(nèi)部出現(xiàn)溫度、粘度及分離速度的不均，影響遷移、降低效率、使區(qū)帶變寬。由于這種負面影響與電場強度成正比，所以大地限制了電壓的引入，也難以提電泳速度。毛細管電泳使樣品在根細的柱子中進行分離。細柱可減小電流，使焦耳熱的產(chǎn)生減少；同時又增大了散熱面積，提散熱效率，大大降低了管中心與管壁間的溫差，減少了柱子徑向上的各種梯度差，保證了效分離。因此可以加大電場強度，達到100～200V/cm，**提分離質量。

毛細管電泳主要用于哪些實驗？

總的來說，毛細管電泳可用于對有機化合物、無機離子、中性分子、手性化合物、蛋白質和多肽、DNA和核酸片段的分析。具體來說，常見的應用范圍有以下幾個方面：

（1）速DNA測序：由于人類基因組工程的提出，速DNA測序引起了廣泛注意，由于對核苷酸及其聚合物的分辨率，毛細管電泳在DNA測序中的應用潛力也受到重視。在電場和使用陣列毛細管條件下，其潛在的測序能力遠遠超過了現(xiàn)有方法。

（2）手性分離現(xiàn)代社會中，手性分析常牽涉到人類生命、動植物的生存和演化，在**研究和生產(chǎn)中也是必須考慮的問題，研究證明手性手細管電泳是簡單效的手性分析方法。手性應用的研究包括異構體拆分、能度測定、反應動力學研究、手性**篩查等。

（3）蛋白質分析蛋白質分離分析也是毛細管電泳的主要應用方向，包括：蛋白和多肽的純度分析、結構研究、結合蛋白的研究、生化及其過程分析、物化常數(shù)的測定，臨床醫(yī)學研究等。

（4）糖分析糖是自然界中廣泛存在的化學物質，已發(fā)現(xiàn)的蛋白質中90%以上含有糖堿基；糖在細胞識別以及其它生物分子識別中也具有不可替代的作用。但是由于糖的些特殊性質，對它的分離分析有很大的困難。而近年發(fā)展起來的毛細管電泳儀用于糖的分析取得了巨大的成功，成為糖分離分析的有效工具。

（5）單細胞分析毛細管電泳既能研究許多細胞構成的樣品，也能只研究單個細胞，即單細胞分析。單細胞分析技術為生命科學研究打開了新的天地，推動了系列的新研究的出現(xiàn)，已被廣泛應用于生物學、**學、血液流變學、細胞生理學，臨床醫(yī)學，特別是腫瘤研究和器官移植。

（6）聯(lián)用技術聯(lián)用技術的研究將是毛細管電泳儀的重大發(fā)展方向之，與譜、質譜等方法的聯(lián)用將會大大提毛細管電泳儀的應用范圍。

毛細管電泳的基本操作

1．按照儀器操作規(guī)程開機，預熱，輸入毛細管卡套溫度、操作電壓、檢測波長和沖洗程序等各項參數(shù)。緩沖液需過濾并脫氣。沖洗液、緩沖液等放置于樣品瓶中，依次放入進樣器中。

2．毛細管處理的好壞對測定結果影響很大。未涂層的新毛細管要用較濃的堿液并在較高的溫度(例如1 mol/L氫氧化鈉溶液，60℃)沖洗，使毛細管內(nèi)壁活化生成硅羥基，再依次用0.1mol/L氫氧化鈉溶液、水及緩沖液分別沖洗數(shù)分鐘。兩次進樣中間可僅用緩沖液沖洗，當分離性能改變時，必須用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液沖洗，甚至需要用濃氫氧化鈉溶液升溫沖洗。對于凝膠毛細管、涂層毛細管、填充毛細管電泳分析，應按照所附說明書進行沖洗。沖洗時，應將盛溶液的試樣瓶依次置于進樣器中，設定順序和時間進行實驗。

3．緩沖液的種類、pH和濃度，以及添加劑[提高待測組分的溶解度和(或)控制待測組分的解離度]的選擇對測定結果有顯著影響，應照各品種項下的規(guī)定配制，并根據(jù)預試結果進行調(diào)整、優(yōu)化。

4．將供試品溶液瓶置于進樣器中，設定進樣壓力(電動進樣電壓)、進樣時間、正極端或負極端進樣、操作電壓或電流、檢測器等操作參數(shù)，開始測試。可根據(jù)預試或適用性試驗的電泳譜圖調(diào)整儀器參數(shù)和緩沖液等參數(shù)優(yōu)化分析條件，然后采用優(yōu)化后的條件正式測試。

5.測試完畢后用水沖洗毛細管，注意將毛細管的兩端浸入水中保存，如果長久不用應將毛細管用氮吹干，后關機。

6．由于進樣方法的限制，目前毛細管電泳的精密度比用定量閥進樣的高效液相色譜法要差，故定量測定以內(nèi)標法為宜。用加壓或減壓法進樣時，供試品溶液的黏度會影響進樣體積，應使供試品溶液和對照溶液的黏度保持一致；用電動法進樣時，待測組分因電歧視現(xiàn)象及溶液離子強度會影響待測組分的遷移量，也是影響精密度的主要因素。

毛細管電泳方法的影響因素

(一)緩沖液的選擇

緩沖液的組成直接影響毛細管電泳分析的效果，緩沖液的種類、pH和濃度是為重要的影響因素。

緩沖液的種類應遵循下列原則：

，在選擇的pH范圍內(nèi)具有良好的緩沖容量。

第二，在檢測波長處的吸收低。

第三，自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流(焦耳熱)的產(chǎn)生。

在分離特殊性質的成分時，可采用不同的分離模式，通過在緩沖液中添加環(huán)糊精、十二烷基硫酸鈉(SDS)可進行手性物質、中性物質的分離。

緩沖液的pH可影響不同酸堿性的待測組分的遷移速率。當緩沖液的pH低于組分的PI值時，組分帶正電，向陰極遷移，與電滲流同向，因此，組分遷移的總速度大于電滲流；當緩沖液的pH高于溶液的PI值，情況相反，遷移的總速度低于電滲流。

緩沖液濃度的增加，使離子強度增加，能減少組分與和管壁、待測組分之間的相互作用，從而改善電泳分離效果。增加緩沖液的濃度提高柱效的同時，還應考慮擴散和黏度兩個因素。隨著緩沖液濃度的增大，分離電流也會上升，從而使焦耳熱的產(chǎn)量加大，可能影響分離過程。

(二)進樣方法

主要有流體動力進樣和電動進樣兩種方式。

1．流體動力進樣流體動力進樣也稱虹吸進樣、壓力進樣或重力進樣，是常用的進樣方法。其優(yōu)點在于如果樣品的黏度和溫度保持恒定，則進入毛細管的物質量將是固定的；進樣過程中沒有組分歧視效應。但是流體動力進樣會引起雜質干擾、柱效降低的缺點。

2．電動進樣電動進樣又稱電遷移進樣，是通過改變進樣電壓和時間能對進樣量進行控制的方法，進樣量還與電泳淌度有關。因此，電遷移進樣對遷移組分具有歧視效應的缺點，對淌度較大的組分進樣量會大一些，反之則要小一些。

(三)分離電壓

當柱長固定時，隨著操作電壓的增加，電滲流和電泳流速度的值都增加，使遷移時間縮短，但由于電滲流速度一般遠大于電泳流速度，因此表現(xiàn)為組分的總遷移速度加快?？傊谝欢ǖ姆秶鷥?nèi)柱效隨電壓的增加而增加，超過一定電壓時，隨著電壓的增加，焦耳熱的影響加劇，柱效反而下降。因此，在分析過程中可繪制電壓一柱效曲線，選擇佳的分離電壓。

(四)柱溫的選擇

溫度對遷移的影響可通過黏度體現(xiàn)，溫度升高，溶液的黏度降低，導致EOF增大。多數(shù)情況下，較高的溫度可縮短遷移時間。在流體動力進樣時，通過增加溫度可獲得更大的進樣量。因為溫度既可影響化學平衡，又影響動力過程，還能影響蛋白質構型及蛋白質-DNA相互作用，因此可作為優(yōu)化分離的重要控制參數(shù)。

毛細管電泳儀的注意事項

(一)儀器工作環(huán)境

溫度一般為5～35℃，相對濕度一般小于65%。工作電壓為交流電源220V。

(二)儀器操作注意事項

1. 2ml緩沖溶液瓶的液面高度不得低于1/2，也不可超過瓶頸。且瓶口和瓶頸內(nèi)部不得沾有液體，如果有液體存在，應將瓶口和瓶頸內(nèi)壁的液體清除再蓋瓶蓋；否則瓶蓋易滑出，從而導致毛細管及電極的折斷。瓶蓋上的液體殘留可能會導致漏電現(xiàn)象發(fā)生，當發(fā)現(xiàn)緩沖溶液瓶瓶蓋上有液體時一定要立即清除或更換。

2．用于裝廢液的樣品瓶要及時清理，過量的廢液既會污染毛細管，也會造成氣路的阻塞。

3. 緩沖溶液瓶瓶蓋及樣品瓶瓶蓋均不可用洗滌劑長時間浸泡或放入烘箱烘干，否則會導致瓶蓋的老化。此外，當樣品瓶帽使用時間過長或被試劑腐蝕后，可能會出現(xiàn)失去彈性而變硬的情況，在此情況下應更換使用新的瓶帽。

4．應注意儀器的防塵、防潮，并經(jīng)常對電極和接口進行清潔，避免因灰塵堆積造成漏電事故。